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分光光度计核酸的定量

日期:2021-08-23 19:06
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摘要:
     核酸的定量是分光光度计使用频率*高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。核酸的*高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成纷歧,因此其换算系数差别。定量差别类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:1OD 的吸光值辨别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。测试前,选择正确的顺序,输入原液和稀释液的体积,此后测试空白液和样品液。然而,实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者***的问题。灵敏度越高的仪器,表示出的吸光值漂移越大。
     事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范畴内变革,即仪器有一定的准确度和**度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变革,都是正常的。另外,还需考虑核酸自身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移如TE,可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免保存一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的保存干扰测试效果。为了*洪流平减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值*好在0.1-1.5A。在此范畴内混合液不可保存气泡,空白液无悬浮物,不然读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,不然浓度差别太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不可采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须抵达比色杯要求的*小体积等多个操作事项。
     除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个十分重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为卵白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示保存卵白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中保存一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A320一般是0。

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